Ⅰ相代謝穩定性研究原理及實驗方法

1 概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創新藥物研發的重要內容，它不僅決定了創新藥物制劑研發的成敗，而且與創新藥物研發的速度和質量有密切關系。因而，藥物代謝研究在新藥研發工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對于了解藥物在體內的變化過程至關重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內和體外兩種。體內代謝法因藥物在生物體內的分布較廣，加上代謝轉化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產物在體內的濃度比較低，代謝產物的檢測具有一定的困難。體外代謝法在短時間內可以得到大量的代謝產物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產物結果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡單，代謝過程快，重現性好，易大量操作，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍。

1.2 藥物代謝

藥物代謝，又稱藥物的生物轉化（biotransformation），是指藥物經過體內吸收、分布之后，在藥酶的作用下經歷化學結構變化的過程，是藥物從體內消除的主要方式之一。藥物在體內的生物轉化，分為Ⅰ相代謝反應和Ⅱ相代謝反應。

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機體進行生物轉化的主要場所，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶。在肝臟中，參與藥物代謝的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶中以P450酶重要，它是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質。P450酶存在明顯的種屬、性別和年齡的差異，其中以種屬差異表現明顯，不同種屬的P450同工酶的組成不同，因此藥物在不同種屬的動物和人體內的代謝產物可能是不同的。

1.3 藥物的Ⅰ相代謝

藥物在Ⅰ相代謝反應中主要發生氧化、還原和水解的反應，經過Ⅰ相代謝反應，藥物可能帶有一些極性基團，如羥基、羧基等。

氧化反應是多見的第Ⅰ相反應，單加氧酶系是氧化異源物重要的酶，單加氧酶主要存在于滑面內質網的微粒體中，能催化烷烴、烯烴、芳烴和類固醇等多種物質進行氧化。由細胞色素P450、NADPH+H⁺、NADPH-細胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃酶），催化基本反應為：

RH+O₂+NADPH+H⁺→ROH+NADP⁺+H₂O

單加氧酶能直接激活氧分子，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環氧化物，另一個氧原子則被NADPH還原為水。由于一個氧分子發揮了兩種功能，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶；又因底物的氧化產物是羥化物，所以又稱為羥化酶。加單氧酶的反應見圖1：

圖1 加單氧酶的反應

肝細胞微粒體內存在的還原酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶，是第Ⅰ相反應的主要還原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類（見圖2）。

圖2 硝基苯和偶氮苯的還原反應

肝微粒體中含有多種水解酶，如酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分別催化酯類、酰胺類、糖苷類化合物的水解（見圖3），以降低或消除其生物活性。  

                                                                       圖3 乙酰水楊酸的水解反應

2 Ⅰ相代謝穩定性實驗原理

肝藥酶CYP即細胞色素P450氧化酶（CYP450），屬于單加氧酶（momooxygenase），也稱肝微粒體混合功能氧化酶，多位于內質網和線粒體內壁上，參與藥物、致癌物、類固醇激素和脂肪酸等多種內、外源性物質代謝。肝藥酶CYP氧化還原酶（POR）是所有肝微粒體酶的電子供體，通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）將電子傳遞給CYP450酶，CYP450酶得到電子后再與底物發生氧化還原反應，從而發揮代謝活性。

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相酶，其中重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統，在用肝微粒體進行研究時，如加入相應的輔助因子NADPH，則可重組體外代謝體系，從而通過體外溫孵法進行Ⅰ相代謝穩定性研究。

3 肝微粒體體外溫孵法實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統，在體外模擬生理環境條件進行代謝反應，經過一定時間的反應后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產物，并對代謝產物進行初步的分析和鑒定的方法。

3.1 肝微粒體制備

微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內質網自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構，是異質性的集合體。它包含內質網膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質合成、蛋白質糖基化和脂類合成等內質網的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（圖4）：

圖4 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

Ⅰ相代謝穩定性研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環境的條件下進行生化反應的體系。

推薦使用的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，NADPH發生系統（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）；0.5 mg/mL的肝微粒體蛋白；合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育，每個樣品平行3次，以不包含NADPH發生系統的樣品作為陰性對照。于預設的反應時間點，如0，5，10，15，30，60 min后加入等體積預冷的乙腈終止反應。

3.3 原型藥物或代謝產物的檢測

采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產物。圖5為采用LC-MS/MS測定藥物在人、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況，從圖上可知，藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝，但不同種屬間又存在顯著差異。

                                                         圖5藥物在人，犬，大鼠肝微粒體中的代謝情況

4 匯智和源/匯智泰康Ⅰ相代謝穩定性試劑盒簡介

北京匯智和源生物技術有限公司針對藥物代謝研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，開發了一款專門用于Ⅰ相代謝穩定性研究的試劑盒，該產品可直接用于藥物的Ⅰ相代謝穩定性研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經過嚴格的質量檢測，符合Ⅰ相代謝穩定性研究試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現性好。

4.1 產品說明

本產品提供了藥物Ⅰ相代謝研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統及其它組分，可直接用于藥物Ⅰ相代謝穩定性的研究。本產品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據實際需求，選擇不同種屬的肝微粒體。

4.2 試劑盒優勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經過嚴格的質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性高。

穩定—— 本試劑盒穩定性強、易于運輸和保存。

4.3 產品組成

50反應/盒，200μL/反應。

4.4 產品使用說明

本產品需于-70℃冰箱冷凍保存，切記避免反復凍融。試驗具體操作如下：

4.4.1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%。

   b.若實際需要n個孵育體系，則需配置n＋1個體系。

3）將以上混合液195μL/管分裝至1.5mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應，使用秒表計時；

4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入200μL預冷的乙腈終止反應（預冷乙腈：孵育體系體積=1:1）。

4.4.2 對照組

1）陽性對照組：將受試物換為陽性底物；

2）陰性對照組：不加A液、B液；

3）空白對照組：只包含底物和PBS緩沖液。

4.5 運輸條件

干冰運輸。

4.6 使用注意事項

1）驗開始前，請自行準備1.5mL離心管、不同規格槍頭、乙腈、37℃水浴鍋等。

2）產品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷。

3）用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻。

4）-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融。

5)用過程中，也可根據實際實驗需求調整各組分的加入量。