PPB即表示與血漿蛋白結合形成結合態藥物的比例。游離藥物假說認為僅有游離態的藥物才能擴散透過生物膜，到達靶部位發揮藥效；另外游離藥物的比例還顯著影響藥物分布、代謝和排泄的過程，PPB與藥物的諸多藥理性質均有關。

　　影響PPB測定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結合、酯酶代謝等，需根據化合物的特征，結合研究的實際目的，選擇合適的測定方法反應真實的化合物特性。需根據化合物預期治療濃度，個性化的制定試驗濃度，必要時進行不同濃度條件下的PPB測定。其中對于*蛋白結合率的化合物，試驗的微小偏差即會對結果造成較大的相對偏差，此時還需要同步優化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等檢測分析技術。

　　平衡透析法目前是常用的方法，但也存在一定的缺陷，如初始平衡狀態的改變、非特異性結合、體積變換、Donnan效應和蛋白滲漏等。

　　初始平衡狀態的改變是指當游離藥物穿過半透膜時會形成新的游離態-結合態的平衡，由此造成試驗設置濃度與實際平衡濃度的差異，對于PPB存在濃度依賴特性的化合物可能造成結果的偏差。

　　非特異性結合是指藥物與半滲透膜等試驗裝置的結合，可能造成游離藥物濃度的低估，進而影響試驗結果。通常采用聚四氟乙烯(Teflon)制造的試驗裝置以降低非特異性結合的影響。如果非特異性結合現象比較嚴重建議采用超速離心法。

　　體積轉換是指液體在膠體滲透壓的作用下從buffer側移動至蛋白側，由此稀釋蛋白濃度對結合率較低的化合物試驗結果造成影響。當液體轉換比例低于10%時該效應幾乎忽略，孵育時間超過4h可能會加劇該效應，可以通過在buffer側加入右旋糖酐以平衡兩側滲透壓。

　　Donnan效應是指吉布斯-唐南效應，是指帶電粒子不通過半透膜而產生不均勻的電荷，使兩側粒子濃度不一致。尤其對于高離子化且低蛋白結合的藥物，該效應最為明顯，該效應可以通過增加buffer側電解質的濃度來弱化。

　　當半透膜完整性出現問題時會發生蛋白滲漏現象，對于高蛋白結合率化合物，由此會造成游離藥物比例的顯著高估，尤其在孵育時間過長時易發生。