P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）屬于ATP結合盒轉運體（ATP Binding Cassette，ABC）蛋白家族，是一種ATP依賴性的跨膜外排轉運蛋白，在人體中主要由多藥耐藥基因（multi-drug resistance 1，MDR1）又稱為ABCB1基因編碼。P-gp與多藥耐藥和藥物相互作用（drug-drug interactions，DDI）都有關，美國、歐洲和中國的藥品監管部門相繼出臺指導原則，將轉運體介導的DDI研究列為評價新藥安全性和有效性的重要指標，也明確指出應通過體外研究評估在研藥物是否為P-gp的底物、抑制劑和誘導劑，為體內研究提供參考。基于以上需求，IPHASE/匯智和源繼成功構建SLC轉運體細胞，包括OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K后，又成功構建國內-首·家P-gp轉運體膜囊泡，助力新藥研發。

P-gp簡介

P-gp是藥物發現中最為熟知的外排轉運體，可從多種細胞中排出化合物，最早于1976年由研究人員首先在秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞株的質膜上發現，是第一個被克隆的ABC轉運蛋白。

在人體中，P-gp最初被認為是導致急性髓系白血病多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）的外排轉運蛋白，后來逐步發現它存在于多種組織細胞中，如全身各種上皮細胞、肝 細胞、腎細胞，在血液細胞和免疫細胞上也有表達。P-gp主要主動運輸各種疏水化合物，包括小分子化合物、生物堿、以及各種天然或人工合成的有毒物質。

P-gp 由1280個氨基酸殘基組成，由于糖基化程度的差異，分子量在130~190 kDa之間。P-gp分子包括N端和C端兩個同源片段，每個片段各有6個疏水性跨膜區(transmembrane domain, TMD)和1個親水性的ATP結合區(nucleotide binding domain, NBD)。這些跨膜結構區與中性或帶正電的親脂性藥物結合，激活了P-gp的 ATP 酶活性，2個ATP水解釋放的能量供轉運 1個藥物分子，將藥物直接從脂質雙分子層轉運到細胞外，降低藥物的細胞內濃度，從而導致多藥耐藥。

圖1  P-糖蛋白結構

P-gp轉運的研究模型

目前，體外評估由ABC轉運體引起的DDI模型主要包括膜囊泡系統、基于極化細胞的雙向轉運系統以及“三明治"培養肝細胞。

2.1 膜囊泡系統

膜囊泡系統是研究在研藥物是否為P-gp的底物和抑制劑的最-常用的模式。膜囊泡可通過感染昆蟲細胞（如Sf9或Sf21），或轉染哺乳動物細胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等進行制備。囊泡外翻后，原本表達在胞內的轉運體將被外翻至囊泡外，與藥物共孵育時，藥物直接作用于外翻轉膜上的轉運蛋白，轉運蛋白可以將藥物轉運到囊泡內，可檢測藥物的吸收而非外排，即測定囊泡內藥物含量即可反應轉運體對藥物的作用。該模型不但具有操作簡便，無需進行細胞培養的優點，更主要的是如果化合物分子量大，不易透過細胞膜時，細胞模型將無法研究藥物的轉運機制，而外翻膜囊泡模型則不受化合物滲透性的影響。

 圖2 膜囊泡系統的作用機理

2.2 基于極化細胞的雙向轉運系統

基于極化細胞的雙向轉運系統是指能夠自發極化形成完整細胞單層的細胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。將細胞接種在Transwell小室上，培養至形成完整的極化細胞單層，將受試藥物添加到單層細胞的頂端（apical，AP）或基底側（basolateral，BL），測量滲透入接收室中的藥量，根據AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）兩個方向上的表觀滲透系數（apparent permeability coefficient，Papp）計算外排率（efflux ratio，ER），評價化合物是否為該ABC轉運體底物。此外，通過測量探針底物在BL→AP方向的凈流量或ER值的變化，也可以進行化合物對特定轉運體抑制作用的評估。

2.3 三明治培養肝細胞

肝細胞中除了含有豐富的藥物代謝酶，還表達多種重要的轉運體。三明治培養是將肝細胞培養于兩層膠原之間，底層為鼠尾膠使肝細胞貼壁，上層為Matrigen膠使其形成肝板樣結構。培養幾天后，肝細胞形成完整膽小管網絡并同時保持緊密連接，且肝臟轉運體正常表達并定位于恰當的膜區域，可用于轉運體功能研究。

IPHASE轉運體產品

作為體外研究生物試劑引-領者，IPHASE以HEK293為載體，成功構建轉染重組P-gp轉運體，并通過特殊的手段制備成外翻膜囊泡，助力藥物轉運體介導的DDI研究。

IPHASE技術人員以終濃度為1μM的他林洛爾（Talinolol）為底物，分別于ATP和AMP兩個不同的條件下與P-gp囊泡進行孵育，通過LC-MS/MS檢測他林洛爾的轉運情況，結果顯示P-gp轉運體膜囊泡ATP組的轉運活性為AMP組的5.8倍，高于《藥物相互作用指導原則2020》規定的2倍，表明P-gp轉運體膜囊泡構建成功！

圖3 他林洛爾轉運結果分析

除ABC轉運體囊泡P-gp外，IPHASE已成功推出全面匹配指導原則需求的SLC轉運體細胞及配套產品，供客戶自行選擇。同時，ABC轉運體囊泡BCRP也正在優化中，敬請期待……

參考文獻：

[1]曾怡馨,蔣建東,孔維佳.P-糖蛋白抑制劑研究進展[J/OL].中國藥理學通報,1-6[2024-10-14].

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[3]楊慧瑩,趙麗,郭青龍.P-糖蛋白抑制劑的研究進展[J].實用老年醫學,2011,25(02):165-169.

[4]《藥物相互作用指導原則2020》

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