N-亞硝胺類雜質是一類分子中含有N-亞硝基結構的化合物，它們常以痕量濃度存在于食品、煙草、消毒后的飲用水及塑膠制品中，在藥物的生產和制劑制備過程也會不可避免地會產生或者引入N-亞硝胺類雜質。多種Ｎ-亞硝胺類雜質具有遺傳毒性風險，可造成DNA損傷，進而誘發癌癥。因此，需要對含有Ｎ-亞硝胺類雜質的化合物進行遺傳毒性檢測，評估其致突變性和致癌性風險。

N-亞硝胺類雜質

N-亞硝胺類化合物（N-nitrosamines，NAs）是一類含有亞硝基官能團，結構通式為 R1（R2）N-N=O的化合物。其生成機制多樣，包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應，溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用等。

N-亞硝胺類化合物在自然界和食品中廣泛存在，如室外空氣、水、土壤、熏肉、烤肉、酒精-飲料、谷物、奶制品、魚類、水果和蔬菜，但含量較少。在藥物的生產和制劑制備過程也會不可避免地會產生或者引入N-亞硝胺類雜質。多種NAs具有遺傳毒性風險，即化合物存在DNA反應活性，可造成無法修復的DNA損傷，甚至堿基突變，并可進而引發癌癥。遺傳毒性風險通常與劑量無關，存在遺傳毒性的化合物可以在極低劑量水平下導致人體DNA損傷，且該損傷效應可通過遺傳物質的復制而不斷放大。

國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）目前已批準把十余種N-亞硝胺類化合物列入致癌物清單，其中N-亞硝-基二甲-胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）和N-亞硝基二乙胺（N-diethylnitrosamine，NDEA）被歸類為對人類致癌性證據有限，對實驗動物致癌性證據充分的2A類致癌物；還有數種N-亞硝胺類化合物被歸類為對人類致癌性證據不足，對實驗動物致癌性證據充分的2B類致癌物。此外，人用藥品注冊技術要求國際協調會（International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質的 ICH M7指導原則將致癌風險高的NAs列為“關注隊列"，并基于已知的致癌和致突變數據，將其歸為“具有已知致癌致突變性"的Ⅰ類雜質，需要得到最為嚴格的控制。

N-亞硝胺類雜質（N-nitrosamines）產生強烈致癌性的遺傳毒性的物質基礎并非原型物質，而是其代謝產物。在諸多N-亞硝胺類化合物致癌機制中，當前最-廣為接受的是ɑ-羥基化假說，即Ｎ?亞硝胺ɑ-碳上的氫經多種氧化酶和氧合酶（如細胞色素酶P450 CYP2E1和CYP2A6等）羥基化后可形成致癌物。Ｎ?亞硝胺首先被羥化酶激活生成α?羥基化亞硝胺，這是一種不穩定且具有誘變性的中間體，可自發分解成甲醛和甲基重氮羥化物。甲醛可以依次氧化生成甲酸和二氧化碳，甲基重氮羥化物可以分解成烷基重氮離子，它可以與DNA堿基對反應，使DNA堿基烷基化生成烷基鳥嘌呤并誘發致癌反應。以NDMA為例，其具體致癌機理如圖１所示。

圖1 NDMA的致癌機理（來源：藥品中N-亞硝胺類有害雜質）

并非所有N-亞硝胺類化合物均存在致突變性。隨著對藥品中亞硝胺類雜質控制的重視，明確某個亞硝胺類化合物是否具有致突變性是界定其監管限度的關鍵，因此，需要對含有Ｎ-亞硝胺類雜質的化合物進行遺傳毒性檢測，評估其致突變性和致癌性風險。

關于N-亞硝胺類雜質遺傳毒性檢測的增強Ames試驗

Ames試驗，又稱細菌回復突變試驗（Bacterial Reverse Mutation Test)，于1975年建立并不斷發展完善，至今已成為國際上通用的遺傳毒理評價體系的必檢項目，同時也是許多遺傳毒理學新興技術發展過程中對照驗證結果的試驗之一，廣泛應用于化合物的致突變性和潛在致癌性的初篩檢驗。

EMA最新發布的“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product（EMA Q&As指南）"中提到，對N-亞硝胺而言，由于某些N-亞硝胺（如NDMA）在標準Ames試驗的條件下靈敏度低，因此建議采用FDA國家毒理學研究中心提供的增強Ames試驗（Enhanced Ames Test）的測定條件。因為FDA認為，用于Ames測試的標準方法可能不足以表征N-亞硝胺的致突變潛力，在某些情況下會產生已知致突變亞硝胺的陰性結果。對此，FDA國家毒理學研究中心一直在測試不同的條件，以開發增強Ames測試（Enhanced Ames Test），旨在對N-亞硝胺雜質潛在致突變性提供更可靠的評估。

以下為FDA提供的增強Ames試驗（Enhanced Ames Test）條件：

需要指出的是，如果在標準的Ames試驗中產生了陽性結果，則沒有必要使用增強的Ames試驗條件進行額外的試驗。 如果標準Ames試驗是陰性結果，則需要進行增強Ames試驗檢測。如果結果為陰性，還應進行體內致突變性試驗，因為專家成員一致認為，單一的體外突變試驗不足以評估N-亞硝胺化合物的致癌性。如果體內致突變試驗結果也是陰性，則必須進行專家知識和全面評估。在得出N-亞硝胺類化合物的非致突變性結論之前，應徹-底評估其致突變性，因此一些N-亞硝胺類雜質是非致突變但致癌的，這一點必須要引起足夠重視。

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正如前文中提到的，N-亞硝胺類雜質（N-nitrosamines）產生致癌性的遺傳毒性的物質基礎是其代謝產物，結合EMA 關于亞硝胺雜質問答文件中提到的“增強Ames試驗需要使用大鼠肝S9和倉鼠肝S9（Hamster Liver S9）作為代謝活化系統"，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，憑借先進的設備，專業的技術人員和多年研發的經驗，繼成功研發誘導SD大鼠肝S9后，又成功開發出國內-首-家誘導倉鼠（金黃地鼠）肝S9（Hamster Liver S9）。IPHASE誘導倉鼠（金黃地鼠）肝S9是使用苯-巴比-妥-鈉和β-萘黃酮聯合誘導倉鼠（金黃地鼠）的肝臟制備而成，經過了無菌檢查、代謝活性檢測，并以Ames和染色體畸變試驗進行質控，結果顯示誘導倉鼠（金黃地鼠）肝S9與誘導SD大鼠肝S9試驗結果接近，說明倉鼠（金黃地鼠）肝S9符合標準，可滿足體外遺傳毒理試驗需求。

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參考資料：

[1] Questions and Answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products.EMA,2024.

[2] 曹夢茹，葉志偉，汪雋，等. 藥品中N-亞硝胺類有害雜質[J]. 化學進展，2023, 35(12): 1881-1894.

[3] 葉倩，耿興超，張河戰，等. 亞硝胺類遺傳毒性雜質的監管策略及思考[J]. 中國藥事，2021, 35(2): 127-137.

[4] 葉倩，汪褀，文海若. 不同代謝活化條件對 N-亞硝胺類化合物細菌回復突變結果的影響[J]. 中國醫藥生物技術，2022, 17(2): 118-124.

[5] 于穎潔. 藥物中N-亞硝胺類雜質的檢測方法研究[D]. 中國食品藥品檢定研究院. 2021.

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